Pregabalin er ikke en GABAA- eller GABAB-reseptoragonist.
Pregabalin er et gabapentinoid og virker ved å hemme visse kalsiumkanaler. Spesifikt er det en ligand av det hjelpe-α2δ-underenhetssetet til visse spenningsavhengige kalsiumkanaler (VDCCs), og fungerer derved som en hemmer av α2δ-underenhet-holdige VDCCs. Det er to medikamentbindende α2δ-underenheter, α2δ-1 og α2δ-2, og pregabalin viser lignende affinitet for (og dermed mangel på selektivitet mellom) disse to setene. Pregabalin er selektiv i sin binding til α2δ VDCC-underenheten. Til tross for at pregabalin er en GABA-analog, binder det seg ikke til GABA-reseptorene, omdannes ikke til GABA eller en annen GABA-reseptoragonist in vivo, og modulerer ikke direkte GABA-transport eller metabolisme. Imidlertid har pregabalin vist seg å produsere en doseavhengig økning i hjerneekspresjonen av L-glutaminsyredekarboksylase (GAD), enzymet som er ansvarlig for syntetisering av GABA, og kan derfor ha noen indirekte GABAergiske effekter ved å øke GABA-nivåene i hjernen. Det er foreløpig ingen bevis for at effekten av pregabalin er mediert av noen annen mekanisme enn hemming av α2δ-holdige VDCCs. I samsvar med pregabalins hemming av α2δ-1-holdige VDCC-er ser det ut til å være ansvarlig for dets krampestillende, smertestillende og anxiolytiske effekter.
De endogene α-aminosyrene L-leucin og L-isoleucin, som ligner pregabalin og de andre gabapentinoidene i kjemisk struktur, er tilsynelatende ligander av α2δ VDCC-underenheten med lignende affinitet som gabapentinoidene (f.eks. IC50 = 71 nM for L- isoleucin), og er tilstede i human cerebrospinalvæske i mikromolare konsentrasjoner (f.eks. 12,9 μM for L-leucin, 4,8 μM for L-isoleucin). Det har blitt teoretisert at de kan være de endogene ligander av underenheten og at de kan konkurrerende motvirke effekten av gabapentinoider. Mens gabapentinoider som pregabalin og gabapentin har nanomolare affiniteter for α2δ-underenheten, er deres potenser in vivo i det lave mikromolare området, og konkurranse om binding av endogene L-aminosyrer har blitt sagt å være ansvarlig for dette avviket.

Pregabalin ble funnet å ha 6 ganger høyere affinitet enn gabapentin for α2δ-underenhet-holdige VDCCs i en studie. En annen studie fant imidlertid at pregabalin og gabapentin hadde lignende affiniteter for den humane rekombinante α2δ-1-underenheten (Ki = henholdsvis 32 nM og 40 nM). I alle fall er pregabalin 2 til 4 ganger kraftigere enn gabapentin som smertestillende middel, og hos dyr ser det ut til å være 3 til 10 ganger kraftigere enn gabapentin som antikonvulsiv.